真菌基因組DNA提取試劑盒（非柱式）

真菌基因組DNA提取試劑盒

原理簡介
真菌是具有真核和細胞壁的異養生物。種屬很多，已報道的屬達1萬以上，種超過10萬個。真菌通常又分為三類，即酵母菌、霉菌和蕈菌（大型真菌）。對于酵母菌和霉菌，可以用玻璃珠處理，而對于大型真菌，可直接用液液氮研磨。經過前期處理的菌液，再經過裂解液及蛋白酶處理后，玻璃奶吸附DNA，去掉其他雜質，，可得到高純度的基因組。提取純化后的DNA，可以直接用于 PCR/Real time-PCR，sequencing，Southern blot，mutant analysis，SNP 等下游應用實驗。
注意事項
1．由于真菌種類萬千，對于一些特別難處理的真菌，可用液氮研磨，再用玻璃珠振蕩，蛋白酶K處理，一般都可以得到一定量的基因組DNA，如電泳檢測很弱，一般PCR都會有較好結果。
2．如果DNA提取量很少，可加長玻璃珠處理時間，如果提取DNA PIAN段很短，成彌散條帶，可減少玻璃珠處理時間。
操作步驟
1．樣品的處理：
1）對于酵母菌，取1-2ml培養好的菌液，離心收集，棄上清。加入300ul 裂解液，加入10ul RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩，約5-10min。
2）霉素(孢子也可相同處理)：取50-100mg菌絲，加300ul裂解液，用玻璃研磨器適當研磨分散菌絲，加入10ulRNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩，約30min。
3）大型真菌（如蘑菇等）：稱取50-100mg樣品，倒入適量的液氮，立即研磨重復3 次，使樣品研成粉末（如無液氮，可加300ul裂解液后用玻璃研磨器適當研磨），加300ul裂解液，加入10ul RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩，約5min。
2．加入10ul 10mg/ml的蛋白酶K，充分混勻，55℃水浴消化，15－30min。消化期間可顛倒離心管混勻數次。
3．12000轉離心2min。將上清轉移到一個新的離心管中。如有沉淀，可再次離心。
4．在上清中加入三倍體積無水乙醇，充分混勻。
5．12000rpm離心5分鐘，去上清，核酸在沉淀中。
6．沉淀中加入500ul結合液，55℃水浴1-2分鐘，核酸沉淀可溶解。
6．玻璃奶搖勻。加入50ul搖勻的玻璃奶，混勻，室溫放置2分鐘，10000轉/分鐘離心1分鐘，去上清；沉淀加入1ml 70%乙醇，振蕩混勻，10000轉/分鐘離心1分鐘，去上清，70%乙醇重復洗一次，再用無水乙醇洗一次。去上清，再次離心2分鐘，用小吸頭吸去上清。
7．室溫放置10分鐘（如果玻璃奶加量，請適當延長放置時間，此步為去除殘余酒精，以免影響下游實驗），加入50－100ul TE緩沖液混勻溶解，55℃水浴5分鐘。離心，取上清為所提基因組。
8．電泳或者其他方法檢測，進入下游實驗。